前言
多发性骨髓瘤是一种浆细胞异常增生的恶性肿瘤，目前普遍认为其预后不良与T细胞功能障碍有关，不同的免疫功能由高度分化的免疫细胞类型决定。以往的研究关注随着疾病进展的CD4+和CD8+T细胞的变化，但普遍采用流式细胞术或RNA检测的方法，其是否能直接反应疾病状态或影响预后仍存在争议。同时，由于患者外周血分选T细胞不同亚型所获得的细胞量极少，急需一种针对纳克级样品的蛋白质组检测方案，从蛋白质层面评估不同免疫细胞类型对多发性骨髓瘤的预后的影响。
2021年南方科技大学田瑞军课题组基于前期开发纳克级蛋白质组学样品前处理技术——SISPROT，在单个多发性骨髓瘤患者的4mL外周血内分离并解析了8种原代T细胞亚型的深度蛋白质组特征，并进一步开发了机器学习模型用以对T细胞不同亚群做精细化分型。该项结果已发表在Analytica Chimica Acta杂志上。
一、基于细胞分选的纳克级蛋白质组学方法开发
T细胞是抗癌的基本效应细胞，特别是对血液系统恶性肿瘤患者，因此，阐明T细胞亚群之间的蛋白质特征对于理解肿瘤微环境的免疫抑制有重要意义。然而，临床患者获得的血液样品有限，并且质谱常规参数不适用于纳克级样品检测，因此作者对分选、样品前处理及质谱参数均进行了优化：分选时，优先分选CD8+T细胞，从CD8-T细胞中分选CD4+T细胞以减少CD8+T细胞损失；采用10 μL的SISPROT低蛋白吸附枪头以减少蛋白质的非特异性结合；降低最小AGC目标、提高MS2分辨率和降低top-N等方式提高蛋白检出。优化后，10 ng 293T细胞样本检测到的蛋白和特征肽段分别提高了5.1和7.8倍。
图1. 8种T细胞亚群的蛋白质组流程及优化结果
二、CD3+、CD4+和CD8+T细胞蛋白质组学特征
以293T细胞作为对照，分别在293T及CD3+、CD4+和CD8+T四种细胞类型样品中分别鉴定到7792、7290、7092和7132个蛋白质。尽管PCA分析中，CD4+和CD8+T细胞并不能很好的区分开，但是火山图显示两者差异蛋白较多，并且特征蛋白也得到了富集，如标志物蛋白CD4和CD8，组内平行性也一致。生物学过程的功能富集显示，293T主要富集核酸代谢过程和RNA过程，而三种T细胞则主要富集免疫调节、信号转导相关功能。
图2. CD3+、CD4+和CD8+T细胞蛋白质组特征
三、8种T细胞亚群的蛋白质组学分析
作者进一步对单个多发性骨髓瘤患者外周血的8种T细胞亚群进行了蛋白质组学分析，为了更好的理解不同T细胞亚群的功能，CD4+T细胞根据功能亚型分类，而CD8+T细胞由于缺乏足够的功能研究，因此按细胞分化程度分类。流式分选后，由于不同T细胞亚型获得的细胞数量差异较大，BCA测定蛋白含量最少的样品仅为77 ng。归一化后，在8个T细胞亚群中，平均鉴定到4000个蛋白质，其中超过70%的FACS标记蛋白被检测到，并且其表达水平与已知的细胞亚型特征一致。此外，作者发现CD4+和CD8+T细胞的13个差异蛋白里，只有两个与公共数据集健康人的免疫细胞蛋白质组数据相符，说明多发性骨髓瘤患者的CD4+和CD8+T细胞的蛋白质组构成有很大差异。
图3. 8种T细胞亚群蛋白质组学结果
四、机器学习精细化区分T细胞亚群
对多发性骨髓瘤患者来说，基于蛋白质组学的CD4+和CD8+T细胞亚群此前未有报道，并且T细胞亚群之间尽管差异较小，但在蛋白质表达上存在实质性差异，因此作者开发机器学习模型进一步筛选8种T细胞亚群的特征差异蛋白。首先，通过随机森林模型，依据T检验筛选的差异蛋白分选CD4+和CD8+两类T细胞。然后，通过支持向量机（SVM）模型，依据方差分析筛选的差异蛋白对CD4+和CD8+T细胞的四个亚群进行分类。并且通过随机森林模型对单一亚群vs其余亚群进行交叉验证。CD8+T细胞的前15个差异蛋白高度富集细胞过程、生物粘附和免疫粘附，而CD4+T细胞的前15个差异蛋白则主要富集细胞成分组织和对刺激的反应，再次证明了CD4+和CD8+T细胞之间的差异。
图4. 机器学习用以精细化分选8种T细胞亚群
总结
综上所述，作者基于流式细胞分选、纳克级样品前处理（SISPROT）、质谱条件优化和机器学习数据分析实现了对免疫细胞亚群检测的细胞类型蛋白质组学。证明了从单个临床患者获取的少量外周血样品，也可以进行免疫细胞的分选和高深度蛋白质组的检测。这一实验方案对进一步研究疾病中免疫功能的失调、细胞类群之间的信号转导提供了切实可行的实验设计参考，为发现新的亚型特异性标记物及药物靶点提供了全新的研究视角。
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