近年来，随着一系列集成化的样本前处理技术和肽段组分分级技术的问世，蛋白质组学的灵敏度和通量得到了显著提升。南方科技大学田瑞军课题组发表了题为《Integrated proteomics sample preparation and fractionation: Method development and applications》的综述性文章，全面梳理和比较了各种集成化方案以及它们在不同样本类型中的应用，为相关领域的研究者提供了宝贵的参考。
PART.1
集成化样本前处理方案比较
样本前处理是蛋白质组学研究中的重要环节，主要包括蛋白质提取、还原、烷基化、酶解和除盐等步骤。传统的溶液内酶解方法存在耗时长（通常需要过夜酶解）和样本起始量多（通常>100mg）的问题。因此，如何将蛋白质组学样本制备所需的不同步骤和试剂进行整合成为了集成化流程的核心挑战。目前，根据蛋白质酶解机制，有三类整合方案：1、溶液内酶解（in-solution）；2、on-beads酶解；3、固定化酶反应器（IMER）。
表1. 溶液内酶解的代表性方法及特点
在近20年里，溶液内酶解一直是蛋白质组学研究的主要方法。然而，这种方法通常需要100微克到1毫克样本，并涉及到多步样本转移，这会导致大量样本损失，从而限制了在微量样本中进行蛋白质组学检测的能力。为了解决这个问题，目前已经开发出三种具有代表性的方案，可以对微量样本进行高效的前处理：最早的FASP方案、用于微量样本的iST方案和基于纳米孔的nanoPOTS。其中，尽管iST方案已经有商品化版本，但仍存在无法兼容高浓度去污剂的问题。并且，由于C18和蛋白质存在不可逆吸附，在微量样本检测时有潜在的样本损失风险。
图1. iST方案流程示意图
表2. on-beads酶解的代表性方法及特点
为了进一步降低样本量的需求和尽可能集成化还原、烷基化等前处理步骤，on-beads酶解方案因其可以集成大多数前处理步骤、显著提高反应效率和可重复性高等特点，被广泛使用，其中代表性的方案有SISPROT、STrap和SP3等。其中SISPROT方案实现了蛋白质组学样本制备和高pH 反相分级的完全集成化，通过离子交换原理实现对微量样本蛋白质富集的同时，很大程度上避免了蛋白质和C18的直接接触，因此大大提高了酶解效率和分级效率，减少了样本的损失。
图2. SISPROT方案流程示意图
此外，尽管固定化酶反应器（IMER）方法可以实现分钟级酶解微量样本，但是该方案个性化程度较高，难以形成商业化版本广泛应用到各类蛋白质组学场景中。因此目前还处于技术方案开发或实验室阶段。
PART.2
全集成化2D/3D-SISPROT方案
蛋白质因其众多的异构体和翻译后修饰，通常在生物体内有巨大的丰度差异，为了尽可能全面的表征样本内全蛋白质表达水平，十分有必要对酶解后的肽段进行分级。根据技术原理，可分为反相色谱分级和离子交换色谱分级两种。
表3. 不同色谱分级方案特点
为了进一步提高色谱峰容量，通常会采取多维度肽段分离方案，即结合具有正交分离能力的不同分离色谱柱，实现对低微克级样本起始量的高深度蛋白质组学检测。基于SISPROT技术，可以集成样本制备、离子交换色谱分级和高pH 反相色谱分级于一体，实现三维肽段分离。第一维：细胞裂解物在离子交换树脂上进行酶解和分级；第二维：在C18膜片上进行高pH反相分级；第三维：低pH RP LC-MS分析。通过采用集成化的SISPROT技术，可以实现蛋白质组学样本前处理的完全集成化，并且由于全部流程是通过离心的方式驱动，因此可以实现批量样本的同时处理，为进一步自动化前处理方案提供了坚实的技术基础。
图3. 2D/3D-SISPROT工作流程
PART.3
集成化样本前处理技术的多场景应用
血液作为临床最容易获取的样本类型，通过蛋白质组学全面、无偏表征血液内的蛋白质表达水平为发现新型标志物提供了可能。然而，血液中蛋白质丰度的动态范围极大，使得低丰度蛋白检测存在很大挑战。此外，临床患者的个体差异要求临床蛋白质组学课题需要更大的入组队列。因此，迫切的需求集成化、自动化的样本前处理方案，来提高整体检测通量和稳定性。
图4. 自动化血液样本蛋白质组学前处理方案
基于组织的蛋白质组学可以提供关于细胞状态和组织微环境信息，集成化的前处理方案可以大大提高对组织异质性的解析能力，并使高分辨率的空间蛋白质组学成为了可能。通过将激光显微切割、SISPROT前处理技术和质谱检测结合，开发的LCM-SISPROT方案既实现了H&E染料的有效去除，又实现了对微小切割区域的高深度蛋白质组学检测。并且，通过进一步升级，作者实现了空间的N-糖基化蛋白质组学检测。
图5. LCM-SISPROT流程示意图
相较于体液和组织，细胞样本可以更深入研究细胞间的信号传导，特别是蛋白复合物和翻译后修饰的表征。针对珍贵的原代细胞和罕见细胞类型的高深度蛋白质组学检测已经成为集成化前处理技术最成功的应用领域之一。应用案例：《蛋白质互作研究方案新升级！应用流程亲测有效》。这些成功案例充分证明了集成化前处理技术在蛋白质组学中的重要性和实用性。
本文详细对比了目前的集成化方案，并介绍了这些集成化方案在不同场景的应用。这些方案为生物学研究提供了重要的技术基础，使得我们能够深入研究组织异质性、发现新型生物标志物和药物靶点。随着生物学研究的不断深入，集成化蛋白质组学样本前处理技术的持续发展对推动研究进展具有重要意义
关于贝普奥生物
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深圳市贝普奥生物科技有限公司是一家于2022年1月在深圳成立的蛋白质组学研发型高科技公司。作为蛋白质组学上游市场解决方案提供商，公司致力于对蛋白质组学领域的研发成果进行商业开发及转化。团队以受多项专利保护的蛋白质组学前处理系列产品为切入点，通过临床功能蛋白质组学技术平台为目标市场提供全流程解决方案。
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