重症新冠肺损伤的深度空间蛋白质组学图谱
作为新冠病毒的主要靶器官，肺部在感染后会表现出异质性的微环境，并且伴有各种组织病理学的变化。虽然目前已经开发了多种疫苗和靶向药物，但是对于重症的新冠患者，仍然没有足够的治疗手段，主要原因为对新冠感染相关的多器官损伤和衰竭机制了解不足。新冠大爆发后，有一系列研究利用scRNA-seq和DSP技术系统性描绘了新冠进展过程中肺部各个区域的转录组图谱，但是对于蛋白质组学的检测，大都是基于块状组织样品检测（bulk tissue检测）的结果，不可避免地损失了空间和细胞类型信息。
近日，中国科学院武汉病毒研究所石正丽教授课题组联合南方科技大学田瑞军教授课题组和华中科技大学同济医学院周亦武教授课题组，通过整合组织学检查、激光显微切割、超灵敏蛋白质组学样品前处理（SISPROT）和DIA数据采集技术，在71个FFPE样本中，共检测超过一万种蛋白质，系统性绘制了新冠患者肺部七个主要病理结构的深度空间蛋白质组学图谱。为理解新冠病毒引起的肺损伤机制提供了全新的空间维度视角，并为后续的药物靶点筛选提供了坚实的数据基础。目前该项成果已经以预印本的形式发布在bioRxiv上。
一、病理学指导的深度新冠肺损伤空间蛋白质图谱
为了系统表征新冠病毒感染对肺部各区域蛋白质的影响，作者从武汉第一波大流行期间死于新冠感染的11名患者和3名意外死亡的健康人肺部收集了三种关键的肺结构：肺泡上皮（AE）、支气管上皮（BE）和血管（VE）。此外，作者还表征了新冠感染的其他四种标志性肺部病理改变：细支气管粘液栓（BMP）、肺部纤维化（PF）、肺泡炎症（ASI）和增生性II型肺泡细胞（HAT2）。采用优化的空间蛋白质组学方案（优化包括样品前处理、激光显微切割、色谱条件、质谱数据采集等方面），在以上两类人群10个区域的71个FFPE样品中，总共定量蛋白质超过1万种，平均每个区域定量超过8500种。进一步对7个区域的特异性蛋白质进行功能聚类分析，作者确定了7个具有不同功能的蛋白质cluster，表征新冠肺部不同区域。GOBP分析揭示了每个区域特有的生物学过程，例如cluster 1（BE）参与了纤毛组织和纤毛运动；cluster 3（AE）参与气体运输和细胞群体增殖等。这些结果揭示了新冠肺炎肺区域之间不同的蛋白质组特征和功能差异，较好地证明了空间蛋白质组数据集的可靠性。
图1 高深度新冠肺损伤图谱及功能聚类分析
二、三种基本肺结构中蛋白质和相关通路的失调
对比新冠和非新冠组之间三种基本肺部结构（AE、BE和VE）的蛋白质组学结果，PCA分析显示三个区域的新冠和非新冠样品可以很好地区分开，随后筛选差异倍数>2，p<0.05的蛋白质，在三个区域分别筛选到1486、832和912个显著差异蛋白。
AE是肺内负责气体交换的薄壁结构，肺损伤后，过渡态的肺泡上皮细胞（PATS）会显著增加。组学结果表明，PATS的三种蛋白标志物KRT8、CLDN4和IL1R1显著上调，证实了其在新冠患者肺部的存在和扩增。并且NKX2-1（一种肺腺癌致癌基因）的表达上调并通过IF验证，进一步支持了前人报道的PATS细胞为癌细胞样细胞的假设。在新冠患者肺部BE区域，观察到与之前转录组报道一致的CXCL1、CCL19的上调，表明炎症组织损伤加重、肺损伤和呼吸衰竭。在新冠患者肺部VE区域，观察到SAA1和SAA2上调，这些蛋白也在重症新冠患者血清中富集，显示出其作为感染标志物的潜力。此外，一些下调的蛋白，包括MUC16、PPBP、APOM、APOA1、APOC1和APOB等也与之前的血清转录组和蛋白质组学数据结果一致。
图2 三种基本肺结构的蛋白质组结果
三、新冠肺损伤特殊病理变化的蛋白质特征
作者对PF、BMP、ASI和HAT2四个病理性病变区域的蛋白质进行了进一步的GO和KEGG富集分析，结果表明，在PF区域，与过度胶原沉积和细胞外基质产生相关的一系列生物学过程和信号通路显著富集，如蛋白质羟基化、胶原原纤维组织、胶原代谢过程、糖蛋白代谢过程等。BMP区域中，白细胞活化、防御反应调控、免疫效应过程、活性氧（ROS）正向调控等一系列免疫反应相关的生物学过程显著富集，这也与之前研究发现的气道粘液蛋白和浸润的先天免疫细胞是新冠感染患者肺中主要失调成分结果相符。ASI区域中富集的蛋白主要参与纤维蛋白溶解、急性期反应、脂质分解代谢过程和先天免疫反应等。而对HAT2区域的GO和KEGG分析表明，最显著富集的是表皮发育，这表明AT2细胞的功能障碍可能导致角质化。上述结果揭示了新冠导致肺部损伤不同病理结构的关键通路和蛋白质表达谱，作者随后对其中部分代表性结果进行了IF验证。
图3 PF、BMP、ASI和HAT2区域蛋白质的GO、KEGG功能富集分析
四、病毒入侵宿主和炎症反应相关的蛋白质失调
由于在新冠患者肺部的许多细胞类型中都观察到病毒感染和免疫反应的激活，因此作者构建了一个基于已报道和预测的数据集用于研究病毒入侵、宿主反应和多个肺部区域炎症反应相关的蛋白质失调。结果表明，包括IFITM3、TMPRSS2、CTSB、FURIN等多种病毒感染相关蛋白上调。此外一些关键的免疫调节因子、细胞因子，如SERPINE1、IL1RN、HGF等均显著上调。为了验证组学结果，作者对新冠和非新冠肺组织进行了IFITM3、FURIN、HGF和OSMR的免疫组化染色，结果与组学结果一致。
图4 与病毒入侵、炎症相关的蛋白质失调
综上所述，作者基于激光显微切割、SISPROT微量蛋白质组样品前处理以及质谱检测优化了高灵敏度空间蛋白质组技术方案，并以组织学特征为导向，特征性地描绘了高深度的新冠肺损伤空间蛋白质图谱。该技术方案具有可拓展性和用户友好性，可以采用纳克级起始样品进行深度蛋白质组学分析。基于该方案所得到的空间蛋白质组学数据，观察到一系列新冠肺损伤引起的蛋白质和功能的失调，特别是与免疫反应相关的信号通路。为进一步揭示新冠肺损伤机制提供了全新的空间视角，也为确定治疗干预的潜在靶点提供了坚实的数据基础。
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深圳市贝普奥生物科技有限公司是一家于2022年1月在深圳成立的蛋白质组学研发型高科技公司。作为蛋白质组学上游市场解决方案提供商，公司致力于对蛋白质组学领域的研发成果进行商业开发及转化。团队以受多项专利保护的蛋白质组学前处理系列产品为切入点，通过临床功能蛋白质组学技术平台为目标市场提供全流程解决方案。
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