全自动、集成化蛋白质组样本制备平台在高通量药靶筛选中的应用
近日，南方科技大学田瑞军课题组开发了一种全自动、集成化的蛋白质组学样本制备流程（automated and integrated proteomics sample preparation，autoSISPROT），该技术流程能够实现在2.5小时内同时完成96个样本的蛋白质组样品前处理，即全自动化的完成蛋白质酶解、肽段脱盐和TMT标记等工作。此外，他们还将autoSISPROT与CETSA-MS结合，进一步构建了自动化、高通量的药物靶标识别方案。目前该项成果已经以预印本的形式发表在bioRxiv上。
研究背景
基于质谱的蛋白质组学已经成为系统表征蛋白质丰度、翻译后修饰和蛋白质互作等领域的关键技术。随着生物医学日益增长的大队列蛋白质组学分析需求，对采用单纯传统手动方法处理数百个样本提出了极大挑战，例如存在通量低、极大依赖多步手动操作、多批次处理造成的样本间相关性较差等诸多问题。与此同时，细胞热位移分析结合质谱技术（cellular thermal shift assay-coupled to mass spectrometry，CETSA-MS）是目前药物靶标发现最有力的工具之一，但仍存在药靶鉴定的分析通量低等不足。因此，亟需发展一种全自动化、高通量的样本制备方法以满足大队列蛋白质组学分析及后续的药物靶标筛选工作。
研究内容
全自动集成96通道蛋白质组学样品制备平台（autoSISPROT）开发及性能评估
作者前期研究开发了一种蛋白组学样品前处理技术simple and integrated spintip-based proteomics technology （SISPROT），该技术可以完全集成样品上样、蛋白质还原、烷基化、酶解、TMT标记（可选）和脱盐步骤于一体。AssayMAP Bravo是一种具有96通道移液头的自动化液体处理平台，该平台可以在2.5-20 μL/min的范围内精确控制上下吸打的液体流速。基于集成化的SISPROT技术以及自动化AssayMAP Bravo平台，该研究设计了autoSISPROT流程，通过自动化程序控制SISPROT小柱上的每个步骤所需的流速和处理时间（图1a），实现在2.5小时内自动处理多达96个样品，全程无需人工干预。
图1 autoSISPROT工作流程
为表征autoSISPROT平台的样本制备性能，作者分别对比了autoSISPROT平台和手动SISPROT的差异，以及autoSISPROT平台同时处理96个样品的批次内和批次间的重现性。与手动SISPROT相比，三个技术重复的结果显示， autoSISPROT平台处理的样本定量精密度优于手动处理，表明自动化的autoSISPROT带来的操作误差更小，重复性更高。此外，兼容TMT标记的autoSISPROT平台同样展示了高效的TMT标记效率（图2）。
图2 autoSISPROT对比手工制备
为评估大样本制备时的批次内和批次间数据重现性，作者在三个不同时间处理了三批96通道的HEK 293细胞裂解液（蛋白起始量为10 μg），每批次随机抽取了10个样本进行质谱检测（图3）。三个批次所定量到的蛋白质数目以及肽段0漏切比例（室温酶解1小时）的相对标准偏差均小于3%。三个批次所定量到的蛋白质定量中位CV值都小于13%，表明批次内重现性高。皮尔森相关系数显示，不同批次间样品相关系数大于0.91，批次内两个样本大于0.99。综上表明，autoSISPROT在样本制备中可保障批次内和批次间数据高度重现性。
图3 autoSISPROT平台批次内、批次间性能比较
使用autoSISPROT平台进行自动化药物靶标识别
研究者以甲氨蝶呤（methotrexate ，MTX）为模型药物，通过典型的CETSA-MS实验设置获得40个样品，用来检测autoSISPROT识别药物靶点的可行性（图4a）。通常进行40个样本的前处理获得用于LC-MS分析的TMT标记肽整个过程都依赖于手动操作，需耗费超过一天的时间才能完成，而利用autoSISPROT平台与CETSA-MS技术相结合进行同样40个样品的制备则将用时缩短至3.5小时。与此同时，鉴定结果呈现出良好的重复性（图4b）和较高的TMT标记效率（>94%），且能够非常显著的识别MTX的已知靶标-二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）（图4d-e）。以上结果表明autoSISPROT能够有效、准确地识别药物靶点，为药物靶标识别提供了一个自动化的样本制备平台。
图4 autoSISPROT用于药靶识别
高通量药物靶点识别的方法探究与优化
经典的CETSA-MS技术受限于TMT标记试剂通道，难以突破真正意义上的高通量，很难满足大规模药靶筛选对高通量的需求。为了探究高通量药靶识别的可行性，该研究对将TMT和DIA用于CETSA-MS的两种分析方法（分别称为tmtCETSA和diaCETSA）进行了比较（图5a）。具体的比较方案是以staurosporine（一种泛激酶抑制剂）为模型药物处理K562细胞裂解物并在52°C下进行热处理，然后采用 diaCETSA和tmtCETSA方法分别平行处理可溶性裂解物。diaCETSA和tmtCETSA两种方法在蛋白质水平上均获得较高的Pearson相关系数（> 0.98）和良好的定量精度（中位CV值< 10%）（图5c-d），表明这两种方法均具有良好的定量重复性。此外tmtCETSA和diaCETSA两种方法分别鉴定出120个和106个staurosporine蛋白靶点，且均满足显著性标准。该研究还进一步优化了diaCETSA方法以提高蛋白质组分析的深度，并将经过探索优化的最佳样品制备方法和质谱仪条件等应用于后续的diaCETSA 分析。
图5 高通量药靶识别的方法探究
实现高通量药物靶点识别的可行性案例
该研究进一步结合autoSISPROT与diaCETSA的方法进行高通量的药物靶点和非靶点鉴定，与经典的CETSA-MS 相比，该方法将分析通量提高了 10 倍以上。通过autoSISPROT自动化处理 87 个样品，对20种激酶抑制剂（kinase inhibitors，KIs）进行基于diaCETSA方法的靶标鉴定，蛋白鉴定数据分析结果表明整个样品制备过程中都具有良好的处理精度，在20种KIs中成功鉴定了12种KIs的已知靶点（图6）。此外本方法还实现了潜在脱靶靶点的高通量鉴定。综合以上结果和分析表明，autoSISPROT和diaCETSA联合能够以全自动的方式鉴定药物靶标和非靶标，实现高通量的药物靶标鉴定。
图6 高通量药靶识别案例
研究总结
这项研究开发了一个全自动、集成式的蛋白质组学样本制备工作流程（autoSISPROT），实现了2.5小时内同时处理96个样本。此外，通过将autoSISPROT与CETSA-MS结合，利用DIA数据采集策略，实现了高通量的药物靶标筛选鉴定。总之，该研究为高通量蛋白质组学样品制备和药物靶标鉴定开发了一套全自动和集成化的工作流程。
参考文献：
1. Qiong Wu et al. Fully automated and integrated proteomics sample preparation platfROm fRO high-throughput drug target identification, biROxiv, 2023
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