蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成成分，它通过与其他生物分子的互作来执行其生物学功能。基于质谱检测研究蛋白质互作的技术包括亲和纯化质谱（AP-MS）、化学交联质谱（XL-MS）、蛋白质共分离/洗脱质谱（CF-MS），以及结合热临近共聚集（TPCA）和细胞热位移分析(CETSA)的热蛋白质组学分析技术（TPP）。传统的TPP和TPCA工作流程对样品量要求较高，通常每个温度点需要超过100μg的蛋白质，这将极大地限制其在稀有细胞和珍贵临床样品中的应用。
2023年9月，南方科技大学Chris Soon Heng Tan教授团队在Analytical Chemistry发表题为“Scaled-Down Thermal Profiling and Coaggregation Analysis of the Proteome for Drug Target and Protein Interaction Analysis”的研究论文，通过结合SISPROT技术（基于spintip的集成化蛋白质组学样品前处理技术）和基于SISPROT tip的TMT标记技术开发了名为STASIS的工作流程，将样品需求量从100μg降低至1μg，成功地将TPCA的应用范围扩展到罕见的原代细胞和宝贵的临床样品中，以分析其中蛋白质复合物。
一、STASIS方案建立：提升低微克级批量样品的结果均一性
传统的TPP和TPCA流程对样品量要求较大，因此作者首先对传统流程进行优化，达到对微量样品的检测中获得与传统方案相似的灵敏度和精度，主要调整包括：使用SISPROT样品前处理技术，样品在同一个spintip中完成还原、烷基化、酶解、TMT标记和除盐过程，减少了传统方案在样品转移过程中可能导致的样品损失。与溶液中所需的100μg蛋白质相比，SISPROT所需的蛋白质量大大减少，仅需0.1-10μg的蛋白质。并且，作者通过调整SISPROT上的肽段pH，实现了在同一个spintip上进行TMT标记。与传统的溶液标记方法相比，基于SISPROT标记不仅大大减少了TMT试剂的使用量，还实现了批量样品的平行处理，提升了检测样品通量和结果均一性。进一步对比了不同分离策略，作者确定了C18-18/6F分离方法质谱分析时间短、共分离干扰分布均匀、各组分间鉴定的多肽重叠最少，为最佳的分离方法，在后续实验中使用。
二、STASIS方案验证：1μg蛋白即可实现强稳定性和高灵敏度
确定分离方案后，作者评估了在经典TPP实验设计下，使用不同初始蛋白量（10μg、5μg和1μg）测试STASIS的稳定性和灵敏度。结果表明，10μg、5μg和1μg分别鉴定到4914、4428和4096个蛋白质，整体灵敏度较高。接着作者对比了不同蛋白起始量的组内Tm的重复性，虽然随着起始量的降低，Tm的重复性会略有降低，但结果依旧令人满意。而对不同起始量中Tm的比较，作者发现1μg样品的Tm与5μg和10μg样品的Tm相关性较弱，考虑主要是由于蛋白质浓度较低时，蛋白质共聚集或沉淀减弱，但随后的实验表明这并不妨碍使用1μg的蛋白起始量来进行蛋白质互作分析。
三、STASIS方案应用于低微克级样品的蛋白质互作分析
TPCA假设相互作用的蛋白质在热变形过程中共聚集，具有类似的热熔曲线，因此通过量化相互作用蛋白之间热熔曲线的相似性来评估蛋白质之间的相互作用。本文中，作者对三组不同蛋白质起始量得到的TPP数据分析其TPCA特征，发现与已报道的数据具有高度的相似性。另外，令作者惊喜的是，使用不同起始蛋白量获得的TPCA特征对相互作用蛋白质对的可预测性非常相似，对于10μg、5μg和1μg起始蛋白量，AUC分别是0.64、0.63和0.64，即使样品起始量低至1μg，也不影响TPCA的整体特征。作者认为这是由于TPCA特征是基于三个生物学重复中获得了10个温度点的平均值，因此减轻了质谱读数的随机波动，使得无论起始的蛋白量多少，蛋白质复合物的热熔曲线相似度都比较高，如下图中MCM复合物所示，在10μg、5μg和1μg蛋白起始量下，得到相似的热熔曲线。以上结果表明，STASIS流程适用于微量样品，如罕见细胞的蛋白质互作分析
四、STASIS方案实测：高效识别药物靶点
最后，作者使用经典TPP实验设计，即10个温度点验证了STASIS流程识别甲氨蝶呤（MTX）和帕比司他（PAN）结合靶点的能力。结果显示，经过药物处理的样品中Tm显著增加，证明了STASIS流程对于微量样品的稳定性和灵敏度。同时，与预期结果一致的是，不论是MTX的结合靶点DHFR，还是PAN的结合靶点HDAC1、HDAC2均被识别出来。证明STASIS流程可用于识别药物结合蛋白质靶点，具有较高的灵敏度和特异性。
综上所述，作者通过SISPROT样品前处理技术，开发了STASIS流程，使得用更少的蛋白质起始量和TMT标记试剂量进行热蛋白质组学研究，最少仅需1μg/温度点，并且成功地鉴定了MTX和PAN的内源性靶点。极大地扩展了热蛋白质组学研究的应用范围，使得从罕见的原代细胞或珍贵的临床样品中直接进行蛋白质互作研究成为了可能。
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深圳市贝普奥生物科技有限公司是一家于2022年1月在深圳成立的蛋白质组学研发型高科技公司。作为蛋白质组学上游市场解决方案提供商，公司致力于对蛋白质组学领域的研发成果进行商业开发及转化。团队以受多项专利保护的蛋白质组学前处理系列产品为切入点，通过临床功能蛋白质组学技术平台为目标市场提供全流程解决方案。
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